中华劳动卫生职业病杂志2015年7月第33卷第7期　Chiuj Ind HYg Occup Dis.Jul 2015, Yol33，No.7

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汉防己甲素和乙酰半胱氨酸联合用药对实验性矽肺的疗效观察

　　作者：肖芸、夏海玲、朱丽瑾、李鲜峰、陈日萍、尹先宏、蒋兆强、冯玲芳、陈均强、余珉、楼建林、张幸

　　【摘要】  目的  比较汉防己甲素（TD）、N-乙酰半胱氨酸（NAC ）单独和联合给药对大鼠矽肺的治疗效果。  方法   40只大鼠分为盐水对照组，矽肺模型组、TD治疗组（50 mg/kg）、NAC治疗组（500 mg/kg）、联合治疗组（TD 50 mg/kg +NAC 500 mg/kg），非暴露法气管内灌注石英粉尘。染尘后第2天起给药，1次/d，6次/周，第30天处死大鼠。计算各脏器系数，观察肺组织病理变化，测定肺组织羟脯氨酸（HYP），丙二醛（MDA ），肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-6（ IL-6）含量。  结果  各治疗组淋巴结系数、联合治疗组肺系数明显低于矽肺模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。病理观察：盐水对照组肺组织结构完好，肺间质无异常；矽肺模型组见多数矽结节，以Ⅱ～Ⅲ级细胞纤维性结节为主；TD治疗组以I级尘细胞性结节为主，NAC治疗组以I～Ⅱ级矽结节为主，联合治疗组仅见极少数细胞性结节,未出现胶原纤维和肺间质纤维组织增生。TD治疗组和联合治疗组HYP含量明显低于矽肺模型组，而NAC治疗组无明显变化。TD、NA及联合治疗组肺组织中MDA含量分别为（18.80±2.94），（20.13±4.01），（17.05±3.52）nmol/ml，均低于矽肺模型组[（23.99±3.26） mnol/ml]。矽肺模型组肺组织中IL-6含量为[9.57±8.78] pg/ml，TD和NAC单独治疗后IL-6下降至[（9.22±9.65）、（81.63±5.72）]pg/ml；而联合用药组用药后，IL-6下降到（74.37±3.17）pg/ml。矽肺模型组肺组织中TNF-α含量为（59.05±4.48） pg/ml,TD和NAC单独治疗后TNF-α含量下降至（50.48±2.76）和（54.28±4.30） g/ml；联合用药组用药后，TNF-α（含量下降至（49.10±4.98） g/ml。与TD、NAC单纯治疗组比较，联合治疗组HYP、MDA、IL-6、TNF-α含量下降更为明显。  结论  TD及NAC能减轻染尘大鼠肺组织纤维化程度，降低肺组织中MDA、TNF-α和IL-6含量，抑制和延缓肺纤维化的发生，两者联合用药疗效优于单一用药。

　　【关键词】矽肺；汉防己甲素；N-乙酰半胱氨酸；联合用药

Study on the therapeutic effects of tetrandrine combined with N-acetylcysteine on experimental silicosis of rats Xiao Yun*, Xia  Hailing,Zhu Lijin,Li Xianfeng, Chen Riping, Yin Xianhong, Jiang Zhaoqiang, Feng Lingfang, Chen junqiang, Yu Min, Lou Jianlin, Zhang Xing. *Institute of Occupational Disease Prevention,Zhejiang Academy of Medical Sciences Hangzhou,Zhejiang 310013, China

Corresponding author: Zhang Xing（E-mail:xingtyou@mail.hz.zj.cn）

　　【Abstract】　Objective　To compare the effects of oral treatment with tetrandrine（TD） and N-acetylcysteine （NAC） separately or jointly） on silica-exposed rats.　Methods　40 sprague-Dawly （SD） rats were randomly divided into normal saline group, quartz group,TD treatment group　（50mg/kg）,NAC treatment group （500 mg/kg） and combined treatment group  （TD: 50mg/kg +NAC: 500mg/kg）.Rats in normal saline group and other groups received intratracheal instillation of normal saline and quartz dust suspension respectively.Treatment groups were given TD, NAC separately or jointly via esophagus the next day after instillation, once a day and six times a week for 30 consecutive days. At the end of experiment, the pathological changes of lung tissues were evaluated by the methods of Foot, HE and Masson staining, the level of hydroxyproline （HYP）,malondjaldehyde （MDA）, tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6（IL-6） in lung tissues were measured by alkaline hydrolysis method,the barbituric acid method and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） respectively.　Results　Compared with the quartz　group,lymph nodes/body coefficients in all treatment groups and lung/body coefficient in combined treatment group were significantly decreased （P<0.05）. Pathology results showed that the normal saline group demonstrated no obvious evidence of lung damage. The quartz group lungs silicotic lesions focused on Ⅱ～Ⅲ level, the TD treatment group was mainly with I level, the NAC treatment group was mainly with I～Ⅱ level, and the combined treatment group only showed little silicotic nodule, no obvious fibrosis. HVP content in TD treatment group and combined treatment group were significantly lower than that in the quartz group （P<0.05, while it showed no obvious change in NAC treatment group.MDA content in lung tissues of each treatment group （TD treatment group,NAC treatment group and combined treatment group） were 18.80±2.94，20.13±4.01 and 17.05±3.52 nmol/ml respectively, which lower than in the quartz group （23.99±3.26 nmol/ml）.The level of IL-6 in lung tissues of the quartz group were 89.57±8.78 pg/ml. After TD and NAC monotherapy，the IL-6 content decreased to 79.22±9.65 pg/ml and 81.63±5.72 pg/ml，and it decreased more significantly after combined medication （74.37±3.17 pg/ml）.The level of TNF-α in the quartz group were 59.05±4.48 pg/ml.After TD and NAC monotherapy, the TNF-α content decreased to 50.48±2.76 pg/ml and 54.28±4.30 pg/ml,and it decreased more significantly after combined medication （49.10±4.98 pg/ml）.　Conclusion　NAC and TD could reduce MDA, TNF-α and IL-6 levels in lung tissue, and alleviate SiO2-induced pulmonary fibrosis in rats. Combined treatment with TD and NAC was more effective than TD or NAC treatment separately.

　　【Key words】 Sillicosis; TD; NAC; Combined use of drug

　　尘肺是我国危害最严重的职业病,其中矽肺和煤工尘肺约占85%，全国有累积尘肺患者70多万例，每年还有2万左右的新发病例。由于矽肺发病机制的复杂性,其治疗问题至今仍未完全解决。本研究采用非暴露气管注人法染尘建立大鼠矽肺模型，比较汉防己甲素（tetrandrine TD）和N-乙酰半胱氨酸（N-acetyleysteine NAC）单独和联合给药对实验性大鼠矽肺的治疗效果，为矽肺治疗临床用药提供实验依据。

　　一、材料与方法

　　1.主要试剂：德国DQ12石英（Quartz）粉尘由中国疾病预防控制中心职业卫生所馈赠。称取粉尘3.0 g,配成30mg/ml石英粉尘生理盐水混悬液，高压蒸汽锅灭菌备用。TD和NAC由浙江金华康恩贝生物制药有限公司生产提供。丙二醛（malondialdehyde，MDA）和羟脯氨酸（hydroxyproline，HYP）试剂盒购自南京建成科技有限公司。肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自武汉优尔生科技股份有限公司。

　　2.动物分组及给药：SD大鼠，雄性，SPF级，体重180～200g，购自浙江省实验动物中心。40只大鼠按体重大小随机化原则平均分成生理盐水对照组、砂肺模型组、TD治疗组（50 mg/kg）、NAC 治疗组（500  mg/kg）、联合治疗组（TD 50 mg/kg+NAC 500 mg/kg），每组8只。所有大鼠乙醚麻醉后，采用非暴露法气管内一次性注人石英粉尘混悬液lml/只，盐水对照组同法注入1ml灭菌生理盐水。染尘后第2天开始灌胃给药，各治疗组每天给药1次，每周6次，生理盐水对照组和矽肺模型组分别给予等量生理盐水，给药至第30天，所有动物放血处死。给药期间每隔1 d测量大鼠体重，每日观察动物状况。

　　3.取材和脏器系数测定：大鼠处死后，打开胸腔取出心、肺、肝、肾、肺门淋巴结，去除周围组织，称取各脏器重量，计算肺和淋巴结系数[肺系数=肺组织湿重（g）/体重（g）；淋巴结系数=淋巴结湿重（g）/体重（g）]。同时切取两肺各叶部分肺组织于10%甲醛溶液中固定。其余肺组织液氮保存，备用测定TNF-α、IL-6、HYP、MDA。.

　　4.病理学检查：肺组织固定后，常规脱水、包埋、切片，HE、Masson晈原、Foot银染色，于光学显微镜下观察病理改变，四级分类法评价矽结节纤维化程度^[1]。

　　5.肺组织中HYP和MDA含量测定：采用碱水解法，按操作说明测定肺组织中HYP含量。用硫代巴比妥酸法（thibabituric，TBA）法，按操作说明测定肺组织中MDA含量。同时采用疗效比（treatment/control，T/C）即治疗组与砂肺模型组该指标数值之比观察联合用药和单一用药的治疗效果。

　　6.肺组织中TNF-α和IL-6含量测定：临用前各组称取等量肺组织，按重量体积比加生理盐水在冰浴下制成10%匀浆，采用ELISA法，按照操作说明测定肺匀浆中TNF-a和IL-6含量。同样采用疗效比（T/C）观察联合用药和单一用药的治疗效果。

　　7.统计学分析:用SPSS17.0分析软件，计量资料用x拔（即平均数）±s表示。多个样本比较采用post hoc tests LSD方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　二、结果

　　1.各组脏器系数和肺干重变化：各治疗组淋巴结系数、联合治疗组肺系数明显低于矽肺模型组，高于生理盐水对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；且联合治疗组淋巴结系数较TD、NAC单纯治疗组下降更明显，差异有统计学意义（P<0.05 ）。各治疗组肺干重、TD治疗组和NAC治疗组肺系数也呈现出低于矽肺模型组趋势，但差异无统计学意义（P<0.05）（表1）。

　　注：与生理盐水对照组比较，^aP<0.05；与矽肺模型组比较，^bP<0.05；与联合治疗组比较，^cP<0.05

　　2.肺组织病理形态学改变：（1）大体观察:生理盐水对照组，大鼠肺呈淡粉色，表面光滑，质柔软富有弹性，无其他异常改变；矽肺模型组，肺体积增大，重量增加，质坚韧，肺表面及切面可见多数粟粒样大小，灰白色细小结节.并可触及质（第521页）稍坚韧的融合病灶；TD治疗组，肺呈淡粉色，肺表面粟粒样点状病灶比模型组明显减少，未见融合病灶；NAC治疗组，肺体积略增大，可见略多的点状或粟粒样病灶，无融合病灶；联合用药组，肺呈淡粉色，质柔软，大小与正常组大鼠肺略同，肺表面少见粟粒样病灶,病变明显轻于其他治疗组。（2 ）光学显微镜下观察：盐水对照组，肺组织结构完好，肺泡腔内未见炎性渗出物或脱落上皮，肺间质无异常（图1A）。矽肺模型组肺内可见多数的矽结节，以Ⅱ～Ⅲ级细胞纤维性结节为主，个别结节胶原纤维轻度玻璃样变，并融合成小片状团块，伴有少量慢性炎细胞浸润。结节邻近的肺泡可见少许炎渗出物（图IB）。TD治疗组肺结构完整，肺泡内充满了大量泡沫样大细胞，可见一些散在分布的I级尘细胞性结节及灶周肺气肿，未见胶原纤维增生（图1C）。NAC治疗组肺结构尚好，有少数I级细胞性结节和肺泡内大细胞及较多的I～Ⅱ级矽结节，以及个别小片状纤维灶（图1D ）。联合用药组肺结构完好,主要表现为肺泡内充满了大量泡沫样大细胞和极少数散在分布的细胞性结节，未出现胶原纤维和肺间质纤维组织增生（图1E、图1F）。

图1 给药1个月后各组大鼠肺组织病理变化

　　A：盐水对照组，肺内未见炎症病变　HE x100；B：矽肺模型组，肺结构破坏，为广泛胶原纤维所代　HE xl00；C：TD治疗组，肺内细胞性结节及肺泡内充满大细胞　HE x200；D：NAC治疗组，肺内Ⅰ～Ⅱ级的矽结节　HE x100；E：联合治疗组，细胞性结节及肺泡内大细胞　HEx200； F：联合洽疗组，同图E矽结节，未见胶原纤维　Masson染色 x200。TD：汉防己甲素；NAC：N-乙酰半胱氨酸

　　3.各组肺组织HYP，MDA含量：从表2可见，各治疗组HYP含量除了NAC组外，联合用药组和TD治疗组HYP含量明显低于矽肺模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。T/C值分别为0.70和0.77。TD治疗组、NAC治疗组及联合治疗组MDA含量均明显低于矽肺模型组，差异有统计学意义（p<0.05）。其T/C值0.71～0.84,联合用药组的HYP和MDA的T/C值分别为0.70和0.71，明显低于TD治疗组和NAC治疗组的T/C值（表2）。联合治疗组HYP含量明显低于NAC治疗组，差异有统计学意义（P<0.05），但各治疗组MDP含量并无明显差异。

　　4.各组肺组织IL-6 ,TNF-α含量：从表3可见，联合用药组和TD治疗组的IL-6、TNF-α含量较矽肺模型组明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。T/C值分别为0.83、0.88和0.83 ,0.85。NAC治疗组的TNF-α、IL-6含量较矽肺模型组降低，差异有统计学意义（P<0.05）,T/C值为0.91、0.92，但效果不及联合用药组。联合治疗组IL-6含量明显低于TD治疗组和NAC治疗组，同时，联合治疗组TNA-α含量较NAC治疗组也明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。

　　注：与盐水对照组比较，^aP<0.05；与矽肺模型组比较，^bp<0.05；与联合治疗组比较,^cP<0.05；HYP：羟脯氨酸；MDA：丙二醛

　　注：与生理盐水对照组比较，^aP<0.05；与矽肺模型组比较，^bP<0.05；与联合治疗组比较，^cP<0.05；IL-6：白细胞介素-6：TNF-α：肿瘤坏死因子α

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